Avances en Investigación Agropecuaria 2024. 28: 185-197
ISSN- L 2683 1716
https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
http://doi.org/10.53897/RevAIA.24.28.27
Efectividad biológica de consorcios microbianos e
inductores de resistencia contra Botrytis cinerea en fresa
Biological Effectiveness of Microbial Consortia and Resistance
Inducers Against Botrytis cinerea in Strawberry
Luis Antonio Guapo Mora1 https://orcid.org/0009-0009-1592-2255 l.antonio.guapo@gmail.com
Gil Virgen Calleros1 https://orcid.org/0000-0003-4172-8885 gvirgen36@yahoo.com.mx
Carla Vanessa Sánchez Hernández1 https://orcid.org/0000-0001-7528-6398
carla.shernandez@academicos.udg.mx
Manuel de Jesús Bermúdez Guzmán2 https://orcid.org/0000-0003-1949-1922
bermudez.manuel@inifap.gob.mx
Ricardo Ramírez Romero1 https://orcid.org/0000-0003-1310-0484 rramirez@cucba.udg.mx
Paola Andrea Palmeros Suárez*1 https://orcid.org/0000-0002-5629-5990
1Departamento de Producción Agrícola, Centro Universitario de Ciencias Biológicas y
Agropecuarias, Universidad de Guadalajara, Zapopan 45200, México.
2Campo Experimental Tecomán, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas
y Pecuarias, Carretera Colima-Manzanillo km 35, Tecomán, Colima, México.
*Autor de correspondencia: paola.palmeros@academicos.udg.mx
Recibido: 15 de mayo de 2024
Aceptado: 28 de julio de 2024
Publicado: 04 de septiembre de 2024
Resumen
Objetivo. Evaluar la efectividad biológica de dos consorcios microbianos e inductores de
resistencia en el cultivo de fresa para el control de B. cinerea y determinar los niveles de
expresión de genes relacionados con la respuesta de defensa en frutos bajo condiciones
controladas. Métodos. La severidad de la enfermedad y la efectividad de los tratamientos
utilizados se evaluaron en plantas de fresa en macro túnel en el municipio de Tapalpa, Jalisco,
México, en dos años de producción (2019 y 2020). Los tratamientos estuvieron conformados
por dos consorcios, tres inductores de defensa y un fungicida. Los genes evaluados fueron
FLS, PG, β-Glu, Chi3 y PR1. Resultados. El análisis de la severidad mostró que hubo
diferencias significativas entre los años evaluados (P=0.003), siendo mayor en el año 2020,
aunque no hubo diferencias entre los tratamientos utilizados; sí hubo menos severidad cuando
se utilizaron los tratamientos con respecto al control (P=0.045). El gen con mayor expresión
fue 1,3 Glu, seguido de FLS y Chi3. En el tratamiento del consorcio 1 se expresaron cuatro
de los cinco genes evaluados a las 24 horas, seguido del consorcio 2, con tres genes.
Conclusión. Se demuestran que los inductores de resistencia utilizados representan una
alternativa viable para el control de la enfermedad del moho gris en el cultivo de fresa.
Palabras clave: Fragaria spp., moho gris, control biológico, genes de defensa.
Abstract
Objective. To evaluate the biological effectiveness of two microbial consortia and resistance
inducers in a strawberry crop for the control of B. cinerea and to determine the expression
levels of genes related to the defense response in fruits under controlled conditions. Methods.
Disease severity and effectiveness of the treatments used were evaluated in strawberry plants
in macro tunnel in the municipality of Tapalpa, Jalisco, Mexico in two production years
(2019 and 2020). The treatments consisted of two consortia, three defense inducers and a
fungicide. The genes evaluated were FLS, PG, β-Glu, Chi3 and PR1. Results. The severity
analysis showed that there were significant differences between the years evaluated
(P=0.003), being higher in 2020, although there were no differences between the treatments
used; there was less severity when the treatments were used with respect to the control
(P=0.045). The gene with the highest expression was 1,3 Glu, followed by FLS and Chi3. In
the consortium 1 treatment, four of the five genes evaluated were expressed at 24 hours,
followed by consortium 2, with three genes. Conclusion. It is demonstrated that the
resistance inducers used represent a viable alternative for the control of gray mold disease in
strawberry.
Keywords: Fragaria spp., gray mold, defense genes, biological control.
Introducción
La fresa (Fragaria x ananassa Duchesne) es un fruto de gran valor nutricional con olor y
sabor agradable, rico en antioxidantes y compuestos bioactivos, por lo que tiene gran
demanda en los mercados de productos frescos y alimentos industrializados (Guapo-Mora,
2023; Newerli-Guz et al., 2023; Pukalskienė et al., 2021). El cultivo de fresa es afectado por
diversos microorganismos, principalmente por hongos fitopatógenos que ocasionan la
problemática fitosanitaria con mayor impacto económico, debido a que pueden causar daños
severos e incluso la muerte de la planta (Garrido et al., 2016). Un ejemplo de estos hongos
es Botrytis cinerea, causante de la enfermedad conocida como moho gris, el cual ocasiona
pérdidas significativas debido a que se reproduce en el fruto, hojas, peciolos, raíces y flores
(Rupp et al., 2017; Petrasch et al., 2019). Asimismo, B. cinerea es considerado un patógeno
de alto riesgo al tener la capacidad de infectar hasta 1 000 especies vegetales distintas debido
a su diversidad genética, ciclo de vida corto y una estrategia de reproducción prolífica
(Boddy, 2016; Cheung et al., 2020).
El incremento en la demanda de producción de fresa ha favorecido el aumento en la
intensidad de las aplicaciones de fungicida para control del moho gris, el cual normalmente
se lleva a cabo mediante la aplicación de fungicidas de síntesis química, generando la
aparición de cepas resistentes a estos compuestos (Weber y Petridis, 2023). Debido a ello, en
la actualidad se emplean métodos de control biorracional, como el uso de microorganismos
antagónicos, los cuales no generen residuos tóxicos y no causan resistencia en los patógenos
(Castañeda-Ramírez et al., 2016). Los hongos del género Trichoderma spp. y las bacterias
del género Bacillus spp. son los microorganismos más utilizados como antagonistas (Cano y
Zarazúa, 2018; Ruíz-Cisneros et al., 2018). Otra alternativa para el control de fitopatógenos
es el uso de inductores de resistencia, que fortalecen las paredes celulares del ataque de
patógenos, almacenando silicatos y lignina en los tejidos de las plantas, induciendo así la
síntesis de fitoalexinas y sensibilizando a la planta para futuros ataques, activando los
sistemas de defensa (Reglinski et al., 2023; Vieira et al., 2024).
El objetivo de la investigación fue evaluar la efectividad biológica de consorcios
microbianos e inductores de resistencia sistémica para el control biológico de B. cinerea en
plantas de fresa en condiciones de macro túnel; así como determinar los niveles de expresión
de genes de defensa en frutos de fresa asperjados con los diferentes inductores en condiciones
controladas. Materiales y métodos
El experimento en campo se desarrolló en un lote comercial de fresa variedad “El Dorado”
bajo túnel ubicado en el municipio de Tapalpa, estado de Jalisco, durante el mes de octubre
de los años 2019 y 2020, cuando las condiciones climáticas (humedad relativa >80% y
temperatura promedio de 22 °C) favorecieron el desarrollo de la enfermedad.
Se establecieron siete tratamientos y un testigo (cuadro 1) con cuatro repeticiones en
un diseño experimental completamente al azar. La unidad experimental consistió de un surco
de 4 m de largo, 1.2 m de ancho (4.8 m2) y de 26 plantas por repetición, se realizaron cuatro
aplicaciones con un intervalo de siete días entre cada una, empleando una aspersora de motor
a cuatro tiempos de la marca HYUNDAI, de doble varilla con boquillas de cono hueco
cubriendo toda la superficie de la planta y frutos.
Cuadro 1
Tratamientos utilizados para el control de B. cinerea en el cultivo de fresa bajo túnel en el
municipio de Tapalpa, Jalisco
Tratamientos
Composición
Dosis por
hectárea
Dosis
aplicada
T1
B. subtilis rv + B. subtilis rv3 +
B. amyloliquefaciens
1.5 L
0.78 mL
T2
B. subtilis rv + B. subtilis rv3 +
B. amyloliquefaciens + Trichoderma harzianum
1.5 L
0.78 mL
T3
Trichoderma harzianum
2.5 L
1.3 mL
T4
Vacciplant (Laminarina)
2 L
1.04 mL
T5
Triviant (fosetil aluminio)
1 kg
0.52 mg
T6
Ecoswing (extracto de Swinglea glutinosa)
2 L
1.04 mL
T7
Kenja (Isofetamid)
1.24 L
0.65 mL
T8
Testigo
N/A
N/A
Por cada tratamiento y repetición se cosecharon cinco frutos de tamaño uniforme, en
madurez fisiológica, dando un total de 20 frutos por tratamiento. Los frutos colectados se
colocaron en cajas de plástico, mismas que se incubaron en una cámara húmeda por cinco
días en condiciones de humedad y temperatura controladas (28 + 2 ºC y 80% H.R.).
Posteriormente se registraron los porcentajes de frutos dañados por B. cinerea (el cual se
aisló de los frutos dañados y se caracterizaron sus parámetros morfológicos macro y
microscópicos mediante la observación de esporas y micelio), se utilizó la escala de Nigro et
al. (2000), la cual considera nueve valores de 0 a 8 donde; 0 = fruta sana; 1 = menos del 10%
de la superficie del fruto con pudrición; 2 = 11-20%; 3 = 21-30%; 4 = 31-40%; 5 = 41-50%;
6 = 51-65%; 7 = 66-80%; 8 = más del 80% de la superficie del fruto con síntomas de
pudrición.
Para los experimentos en campo se realizaron evaluaciones de la severidad en fruto,
una vez que se determinaron los niveles de afectación, a los datos generados se les aplicó la
fórmula de Towsend y Heuberger (1943):
SP = ( (n*v) / (i*N)) * 100)
SP = Media ponderada de severidad
n = número de plantas por cada clase en la muestra
v = valor numérico de cada clase
i = valor de la categoría más alta
N = número total de plantas en la muestra.
Para determinar la media ponderada de severidad. Los porcentajes de efectividad de los
tratamientos en los experimentos fueron comparados con la severidad de la enfermedad
presentada en cada tratamiento, para lo cual se calculó la efectividad del control mediante la
fórmula de Abott (1925), tomando en cuenta el avance de la enfermedad en porcentaje de
una evaluación a otra (figura 1).
Eficacia = Ca -Ta (100) / Ca
Ca= Porcentaje de daño en el testigo después de la aplicación
Ta= Porcentaje de daño en el tratamiento después de la aplicación).
Figura 1
A) Distribución de los tratamientos en macro túnel. B) Fruto de fresa con 20% de hombro
blanco que muestra signos característicos de Botrytis spp. y tejido necrótico en 25% del
fruto C) Fruto de fresa infectado al 75%, y sépalos infectados con micelio y esporas
C
B
A
En el análisis estadístico las variables de respuesta de severidad y efectividad se
analizaron mediante ANOVA anidados (Zar, 1998), con el año como factor principal (dos
niveles: 2019 y 2020) y el tratamiento como factor anidado. Para cada experimento se
realizaron los análisis estadísticos por separado. Los supuestos de normalidad y
homocedasticidad se verificaron previa observación. Todos los análisis se realizaron con el
Software estadístico R 4.0.1 (Team, 2014).
Para la determinación de los niveles de expresión de los genes de defensa se siguió el
procedimiento realizado por Landi et al. (2014), donde se seleccionaron frutos uniformes en
tamaño y con un 20% de hombro blanco, los cuales fueron sumergidos durante 30 s en 1 L
de agua con las concentraciones de cada uno de los tratamientos seleccionados (cuadro 2).
Posteriormente las fresas se secaron al aire libre durante 30 minutos, para luego subdividirse
en dos grupos que fueron almacenados a 20 °C y 95-98% de humedad relativa, tomando el
primer grupo de ellos a las 24 horas después de haber estado en contacto con los consorcios
microbianos e inductores de resistencia y el segundo grupo se colectó a las 48 horas de haber
estado en contacto con los tratamientos. Posteriormente, los frutos se congelaron con
nitrógeno líquido y se almacenaron a -70 °C, hasta la extracción de RNA.
Cuadro 2
Tratamientos utilizados para la determinación de los niveles de expresión de genes de
defensa en frutos de fresa
Tratamiento
Composición
Dosis aplicada
por litro
1
B. subtilis rv + B. subtilis rv3 + B.
amyloliquefaciens
0.609 mL
2
B. subtilis rv + B. subtilis rv3 + B.
amyloliquefaciens + Trichoderma harzianum
0.609 mL
3
Trichoderma harzianum
1.015 mL
4
Vacciplant (Laminarina)
0.812 mL
5
Kenja (Isofetamid)
0.507 mL
6
Testigo
N/A
Para la expresión de los genes se realizó una extracción de RNA total de acuerdo con
el método descrito por Aristya et al. (2020). Se pesaron 500 mg de tejido congelado
pulverizando el fruto de fresa de cada uno de los tratamientos con un mortero y pistilo y se
colocaron en microtubos de 1.5 mL se adicionando 700 µL de buffer de extracción. El tejido
se mezcló con el buffer empleando vórtex y se incubó durante 10 minutos a 65 °C en baño
maría. Posteriormente, la mezcla se centrifugó a 12 000 rpm por 15 minutos a temperatura
ambiente. Se colocó el sobrenadante en un microtubo nuevo y se adicionó un volumen de
cloroformo, se mezcló con vórtex y se centrifugó a 12 000 rpm por 10 minutos a temperatura
ambiente. Después de la centrifugación, la fase acuosa se transfirió a un microtubo de 1.5
mL nuevo y se adicionó un volumen de LiCl 4 M, permitiendo la precipitación del RNA
durante toda la noche a 4 °C. Posteriormente se centrifugó la mezcla a 12 000 rpm durante
15 minutos y se eliminó el sobrenadante. La pastilla se lavó con 100 µL de etanol al 75% y
se centrifugó a 12 000 rpm por cinco minutos a 4 °C, se eliminó el etanol y se repitió el
procedimiento anterior. Finalmente, la pastilla que contenía el RNA se dejó secar a
temperatura ambiente para que se llevara a cabo la evaporación del etanol y se resuspendió
en 30 µL de agua libre de nucleasas.